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再與HRP標記的抗體結合，形成抗體抗原-酶標抗體復合物，經過洗滌后加底物TMB顯色，TMB在HRP陸的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色，顏色的深淺和樣品濃度呈正相關用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標準曲線計算樣品中濃度。

樣品收集、處理及保存方法
1.細胞.上清液: 3000轉離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
2.組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉離心10分鐘取上清.
3.保存:如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
試劑盒性能
1準確性：標準品線性回歸與預期濃度相關系數R值大于等于09900.
2靈敏度：最di檢測濃度小于1.0U/兒
3特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應
4.重復性：板內、板間變異系數均小于15%。
5.貯藏：2-8°C，避光防潮保存。
6. 有效期：6個月

注意事項:
1.嚴格按照規定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
⒉洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
3.消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD值。
4.底物顯色液應呈無色或很淺的顏色,已經變藍的底物液不能使用。
5.避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。
6.在儲存和溫育時避免強光直接照射。
7.平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
8.任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。
9.不能使用過期產品。
10.如果可能傳播,所有的樣品都應管理好,按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。